Laboratorio di informatica e sistemistica

Il laboratorio di Informatica e Sistemistica per la Ricerca Clinica (LISRC) svolge la sua attività nell’ambito dell’informatica medica e della bioinformatica translazionale, il cui scopo è la messa a punto di metodi e tecniche computazionali per l’analisi di grandi basi di dati che comprendano sia informazioni di tipo molecolare che clinico. Il LISRC pertanto si occupa da un lato di realizzare di nuove infrastrutture informatiche per la raccolta, la gestione e l’interrogazione di dati di natura clinica e molecolare, dall’altro dello sviluppo di metodologie bioinformatiche innovative per l’analisi di dati di natura clinica, genetica, genomica e proteomica.

 

Attività di Ricerca

Nel campo delle infrastrutture software di bioinformatica, una delle attività principali del laboratorio riguarda l’utilizzo, la configurazione e la personalizzazione secondo le esigenze di progetto del software i2b2, acronimo di “Informatics for Integrating Biology and Bedside”, realizzato dal Partners Center di Boston e dall’Università di Harvard, grazie ad un finanziamento del National Institute of Health (NIH). Il progetto i2b2 consiste nella realizzazione di una piattaforma informatica per la ricerca biomedica che integri ed utilizzi tutti i dati provenienti dalla pratica clinica e dai ricoveri ospedalieri, mettendoli a disposizione in forma anonima e facilmente accessibile ai ricercatori degli Istituti Clinici Scientifici Maugeri (ICSM).

Il progetto i2b2 è stato pensato per consentire non solo la selezione informatizzata dei pazienti da arruolare per la ricerca, ma anche il reperimento ad alta efficienza di campioni biologici, permettendo non solo di identificare i pazienti con caratteristiche cliniche di interesse, ma anche di verificare la disponibilità di loro campioni biologici all’interno di biobanche.

Un altro importante settore dell’attività del laboratorio riguarda lo sviluppo di basi di dati a supporto della ricerca clinica, attività che ha portato alla realizzazione di registri di patologia di nuova generazione, in particolare nel campo della cardiologia molecolare e della diabetologia. Il laboratorio si occupa inoltre dell’applicazione dei metodi di data mining e machine learning per l’analisi dei dati, e della loro potenziale integrazione nei registri.

Infine, il LISRC si occupa dei metodi bioinformatici a supporto dell’attività di ricerca dell’ICSM nel campo della medicina molecolare. L’attuale disponibilità di tecnologie su larga scala per l’analisi genomica rende possibile la caratterizzazione molecolare delle patologie con il livello di dettaglio richiesto dalla “medicina di precisione”. Per analizzare in modo efficiente i dati è necessario mettere a punto pipeline avanzate per la selezione delle varianti nel sequenziamento di nuova generazione, e di metodi statistici avanzati per la selezione di geni caratterizzati da un espressione genica differenziale fra due o più condizioni di interesse nell’ambito di esperimenti di trascrittomica. Il LISRC si occupa pertanto della definizione di questi nuovi strumenti e dello sviluppo di soluzioni software integrate per l’analisi di dati e conoscenza a supporto della medicina traslazionale.

 

Progetti di Ricerca in corso

Progetto GESTIONE PAZIENTE CRONICO

Sulla base dell’esperienza di successo del progetto MOSAIC,  il LISRC propone uno studio di fattibilità di un sistema informatico di supporto alla gestione dei pazienti cronici con le seguenti caratteristiche: i) gestione di dati caratterizzati da elevato volume e varietà (Big Data) con adeguate soluzioni per la memorizzazione e l’analisi statistica dei dati; ii) integrazione di soluzioni Internet of Things (IoT) e di telemedicina basari su dati generati dai pazienti, in particolare il sensore indossabile FitBit e il sistema di monitoraggio del glucosio FreeStyle Libre (Abbott); iii) impiego di modelli predittivi per una migliore caratterizzazione del rischio clinico di pazienti e degli interventi di prevenzione delle complicanze. Queste caratteristiche permetteranno di costruire un sistema avanzato in grado di trasferire al processo di cura i più recenti risultati della ricerca nel campo dell’informatica medica e dell’Information Technology. Il progetto si colloca in completa coerenza con le strategie regionali contenute nel D.g.r. 4 maggio 2017 - n. X/6551 Riordino della rete di offerta e modalità di presa in carico dei pazienti cronici e/o fragili in attuazione dell’art. 9 della legge regionale n. 33/2009 e in coerenza con la legge regionale 23/11/2016 n. 29 “Lombardia è ricerca e innovazione”, in cui Regione Lombardia si è impegnata a valorizzare l’ecosistema della ricerca e dell’innovazione a sostegno del tessuto economico - produttivo lombardo e del benessere della comunità attraverso interventi volti a regolare e dare impulso agli ambiti strategici dell’innovazione sistemica, del trasferimento tecnologico e della ricerca applicata, dai quali dipendono primariamente competitività e benessere.

 

Progetto TRINETX

ICSM ha recentemente siglato un accordo con TriNetX, una rete federata di centri clinici, aziende farmaceutiche e CRO,  che consente la progettazione di studi clinici multicentrici grazie alla condivisione di informazioni sulle numerosità dei pazienti con determinate caratteristiche cliniche trattati dai centri partecipanti. LISRC ha supportato l’implementazione sicura del software del sistema TriNetX, che utilizza il datawarehouse i2b2 e ha ideato la pipeline di inserimento e pseudo-anonimizzazione dei dati che alimentano il sistema, aggiornato su base settimanale. I dati presenti riguardano i ricoveri del centro di Pavia e le unità operative di Oncologia, Cardiologia, Nefrologia e Pneumologia. Gli sforzi di LISRC si stanno concentrando sul reperimento di informazioni di altre unità operative, delle prestazioni ambulatoriale e di altri centri ICSM.

 

Progetto Biobanca Oncologica Bruno Boerci

Obiettivo del progetto (terminato nel 2012, ma attualmente costantemente seguito e manutenuto) è stata la realizzazione di un’infrastruttura ICT per la gestione computerizzata delle informazioni legate ai campioni di tessuto biologico e sanguigno contenuti nella Biobanca Oncologica Bruno Boerci. Il progetto è stato strutturato in 2 fasi. La prima fase è stata dedicata all’analisi di prodotti software commerciali di tipo LIMS (Laboratory Information Management System) destinati all’immagazzinamento in biobanca delle informazioni legate ai campioni di tessuto biologico. La seconda fase è consistita nell’integrazione tra il prodotto LIMS scelto e il flusso di dati provenienti dal reparto di Anatomia Patologica, in modo tale da poter usufruire in biobanca delle informazioni presenti all’atto di accettazione dal campione presso il reparto di Anatomia Patologica, riducendo così al minimo l’errore umano dovuto all’immissione manuale di informazioni. Questa attività è stata organizzata e gestita dal LISRC in collaborazione con la Direzione dei Servizi Informativi della Fondazione. Attualmente è in funzione il flusso informativo che automaticamente popola la porzione di database destinato all’immagazzinamento delle informazioni presenti in biobanca, a partire dal database utilizzato nel reparto di Anatomia Patologica. Sono state implementate delle routine di Natural Language Processing (NLP) per estrarre automaticamente informazione relative ai campioni biologici dai referti testuali prodotti da Anatomia Patologica. Si prevede di ampliare il flusso informativo analizzando altre sorgenti dati presenti nel Sistema Informativo Ospedaliero, quali le informazioni sui trattamenti chemioterapici e di radioterapia.

 

PROGETTO Inherited arrhythmias: clinical characterization, genetic geography and experimental studies in the Calabria Region isolate

Il LISRC partecipa come unità operativa al progetto “Inherited arrhythmias: clinical characterization, genetic geography and experimental studies in the Calabria Region isolate” finanziato dal Ministero della Salute nell’ambito dei bandi di Ricerca Finalizzata 2011. La durata del progetto è di 36 mesi, ed ha avuto inizio nel novembre 2014. Partners del progetto sono l’unità operativa di Cardiologia molecolare dell’istituto IRCCS di Pavia (nel ruolo di coordinatore e PI) e l’unità operativa di Cardiologia ed Emodinamica dell’Università della Magna Graecia di Catanzaro. Il progetto si pone come obiettivo quello di studiare alcune malattie aritmogene ereditarie (Long QT syndrome, Brugada syndrome, arrhythmogenic polymorphic ventricular tachycardia, idiopathic ventricular fibrillation, arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy) in popolazioni isolate, in quanto caratterizzate da corredo genetico pseudo costante durante gli anni. Sono attualmente in corso analisi di genetica di popolazione e di caratterizzazione fenotipica che consentiranno di verificare la presenza di un eventuale arricchimento in termini di varianti genetiche di interesse. L’analisi del corredo genetico ti tali popolazioni consentirà di migliorare l’identificazione di geni modificati e permetterà lo sviluppo di modelli sperimentali come per esempio iPSC.

 

PROGETTO Correlati clinico-funzionali del recupero dei Disordini della Coscienza da gravi cerebrolesioni acquisite: creazione del network ICS sui Disordini della Coscienza

Il LISRC partecipa al progetto “Correlati clinico-funzionali del recupero dei Disordini della Coscienza da gravi cerebrolesioni acquisite: creazione del network ICS sui Disordini della Coscienza” in collaborazione con il Laboratorio per la Valutazione Multimodale dei Disordini della Coscienza dell’Istituto Scientifico di Telese. Lo scopo del progetto è sviluppare uno studio multicentrico prospettico tra dieci istituti della Fondazione che accolgono pazienti affetti da disordini della coscienza per la gestione della fase post-acuta riabilitativa precoce e tardiva nei reparti di Alta specialità Riabilitativa e di Riabilitazione Intensiva. La realizzazione di un network tra i diversi centri ICSM con già consolidata esperienza avrà lo scopo di fornire informazioni molto utili per la gestione routinaria di tale tipologia di pazienti e fornire evidenze scientifiche all’attuale dibattito di natura medica, etica e giuridica connesso con la loro gestione. Il LISRC si è occupato della creazione e della gestione del registro elettronico necessario per la raccolta dati.

 

PROGETTO START&STOPP

Una prescrizione della terapia farmacologica corretta rimane una delle problematiche principali in sanità. Nel 2008 un team di esperti inglesi e irlandesi ha sviluppato i criteri di STOPP (Screening Tool of Older Person's Prescriptions) e START (Screening Tool to Alert doctors to Right Treatment): un insieme di 87 regole per la valutazione dell’uso appropriato dei farmaci. In questo contesto, il LISRC si è occupato della realizzazione di una procedura automatica, basata appunto su questi criteri, per l’identificazione dell’appropriatezza prescrittiva nella somministrazione di farmaci nei pazienti anziani di ICSM. Il software R è stato utilizzato per realizzare una procedura in grado di applicare i criteri STOPP e START ad un database estratto dal Sistema Informativo Ospedaliero, che raccoglie i dati delle somministrazioni dei farmaci di tutti i ricoveri a partire dal 2012, anno in cui le terapie sono state informatizzate. Il progetto è stato condotto in collaborazione con il Servizio di farmacia di ICSM di Pavia, che ha fornito l’elenco di codici ATC (per le terapie/farmaci) e ICD9-CM (per la patologie) associati alle 87 regole.

 

PROGETTO MTGO

In anni recenti, l’avvento delle tecnologie high-thoroughput nel campo della proteomica e genomica ha portato alla nascita di nuove tecniche e modelli per l’analisi dei sistemi biologici. In questo contesto, le reti di Interazione Proteina-Proteina si sono affermate come modelli per rappresentare i dati proteomici che caratterizzano un determinato processo biologico. Queste reti, composte da migliaia di componenti, sono impossibili da analizzare “a mano”, quindi molti algoritmi sono stati proposti per poterle interpretrare dal punto di vista biologico. Tuttavia, gli algoritmi più diffusi si limitano a fornire un’interpretazione della struttura della rete. In questo contesto, il LISRC si è occupato dello sviluppo di un nuovo algoritmo, MTGO (Module Identification via Topological Information and GO kwnoledge), in grado di sfruttare sia le informazioni strutturali del modello sia la conoscenza a-priori fornita dalla GO (Gene Ontology), per l’identificazione dei principali moduli che compongono il modello rete e dei processi biologici in cui sono coinvolti. Il software MTGO è scaricabile al link https://gitlab.com/d1vella/MTGO.

 

PROGETTO  REGISTRI

REGISTRO SCOMPENSO CARDIACO

Il LISRC partecipa al progetto Registro Scompenso Cardiaco in collaborazione con le unità operative di Cardiologia riabilitativa degli istituti ICSM.. Lo scopo del progetto è sviluppare uno studio multicentrico prospettico tra per pazienti affetti da scompenso cardiaco, una delle condizioni cliniche più gravi e costose per il SSN.  La riabilitazione è indicata nei pazienti con scompenso cardiaco e ha come principali obiettivi il miglioramento della capacità funzionale e della qualità della vita e l’ottimizzazione terapeutica. Dal momento che non si dispone di conoscenze approfondite sulle caratteristiche cliniche e prognostiche e sulla complessità di gestione dei pazienti, un sistema organizzato di raccolta dati potrebbe costituire fonte di nuove conoscenze ed offrire molteplici opportunità di ricerca. Il LISRC si è occupato della creazione e della gestione del registro elettronico necessario per la raccolta dati, realizzato utilizzando la piattaforma Redcap.

 

REGISTRO STROKE

Il LISRC partecipa al progetto “Registro Stroke” in collaborazione con le unità operative di RRF degli istituti ICSM di Pavia, Pavia via Boezio e Telese. Lo scopo del progetto è sviluppare uno studio multicentrico prospettico per pazienti che hanno subito un episodio di ictus. La realizzazione di un network tra i diversi centri ICSM con già consolidata esperienza avrà lo scopo di fornire informazioni molto utili per la gestione routinaria di tale tipologia di pazienti e valutare l’appropriatezza dei Percorsi Diagnostico Terapeutici Assistenziali applicati su tale tipologia di pazienti. Il LISRC si è occupato della creazione e della gestione del registro elettronico necessario per la raccolta dati.

 

REGISTRO PNEUMOLOGICO

Il LISRC partecipa al progetto “Realizzazione di una Banca Dati per la valutazione della funzione polmonare, dell’iper-reattività bronchiale e dell’infiammazione nell’asma e nella BPCO di diversi stadi di gravità” in collaborazione con l’unità operativa di Pneumologia riabilitativa dell’IRCCS di Tradate. Lo scopo del progetto è realizzare un registro come strumento fondamentale per la conduzione di ricerca corrente della popolazione afferente alla struttura. Gli obiettivi sono i) ottenere una fotografia aggiornata dei pazienti, del loro stadio e delle caratteristiche biologiche e funzionali peculiari della patologia respiratoria cronica, ii) fornire agli specialisti un valido supporto nel reclutamento e nella gestione di pazienti per trial clinici.  Il LISRC si è occupato della creazione e della gestione del registro elettronico necessario per la raccolta dati e della creazione di report automatici per la gestione e il reclutamento di pazienti per trial clinici.

 

PROGETTO  REGISTRO PARKINSON

Il LISRC partecipa al progetto  “Il dolore e i disturbi disautonomici nella malattia di Parkinson e nei parkinsonismi atipici: identificazione di pattern predittivi dell’outcome riabilitativo e valutazione dell’impatto sulla qualità di vita” in collaborazione con diverse unità operative degli istituti ICSM. Gli obiettivi del progetto sono: i) valutare l’incidenza e caratterizzare il dolore e i disturbi disautonomici nella malattia di Parkinson e nei parkinsonismi atipici, ii) identificare pattern predittivi dell’outcome riabilitativo, iii) valutare l’impatto del dolore e dei disturbi disautonomici sulla qualità della vita, iv) valutare l’effetto della riabilitazione sul dolore e sulla disautonomia. Il LISRC si è occupato della creazione e della gestione del registro elettronico necessario per la raccolta dati.

 

PROGETTO  REGISTRO TRIAL: USO DEGLI ALTI FLUSSI DI OSSIGENO DURANTE ALLENAMENTO IN PAZIENTI AFFETTI DA BPCO

Il LISRC partecipa al progetto di ricerca sponsorizzata “L’uso degli alti flussi di ossigeno durante allenamento all’esercizio in pazienti con bpco e insufficienza respiratoria cronica” in collaborazione con le unità operative di Pneumologia degli istituti ICSM  di Lumezzane, Pavia, Tradate, Cassano delle Murge. Lo scopo del progetto è quello di valutare, in pazienti con BPCO e insufficienza respiratoria cronica, il miglioramento della tolleranza sforzo (tempo di endurance) prodotto da un programma di allenamento ad alta intensità con alti flussi di ossigeno (HFO) rispetto allo stesso allenamento effettuato con maschera di Venturi a iso-FiO2. Obiettivi secondari saranno quelli di studiare l'efficacia dell’HFO rispetto alla Maschera di Venturi in termini di miglioramento dei metri percorsi al test del cammino, della dispnea, della forza periferica e dei muscoli respiratori, della qualità della vita e dell’impatto della malattia. Il LISRC si è occupato della creazione e della gestione del registro elettronico necessario per la raccolta dati.

 

Progetto MOSAIC

Il progetto MOSAIC (Models And Simulation Techniques For Discovering Diabetes Influence Factors) è stato un progetto finanziato dalla comunità europea tramite nel Settimo programma quadro (FP7). Il progetto, avviato a Gennaio 2013 e terminato nell’Aprile 2016, ha visto la collaborazione di nove partner europei. Attualmente è in corso una fase di ulteriore sviluppo del sistema realizzato presso ICSM.

Il progetto MOSAIC si prefigge di studiare eventi che caratterizzano l’evoluzione del diabete di tipo 2 dopo la diagnosi, attraverso l’integrazione di dati clinici e amministrativi. Le principali metodologie di analisi sviluppate sono basate sull’utilizzo congiunto di tecniche di temporal and process mining per la rilevazione delle storie cliniche dei pazienti e dei modelli comportamentali associati. Grazie all’integrazione di questi metodi è possibile ricostruire i percorsi sanitari dei pazienti e individuare gruppi di soggetti con profili temporali simili. L’obiettivo finale è di utilizzare questa stratificazione a supporto di piani di assistenza personalizzati per il trattamento del diabete e la prevenzione dell’insorgenza di complicanze croniche. Sono stati sviluppati inoltre dei modelli predittivi per il calcolo del rischio di complicanze microvascolari associate alla patologia.

Nel 2017, il LISRC si è aggiudicato il premio “Innovazione Digitale in Sanità 2016-2017” bandito dall’Osservatorio Digitale in Sanità del Politecnico di Milano.

 

Progetti di consulenza statistica

 LISRC collabora inoltre a diversi studi clinici fornendo consulenza riguardo analisi statistiche di dati sia provenienti dalla pratica clinica che dalla ricerca scientifica. In particolare il servizio di consulenza statistica del LISRC si occupa di fornire modelli statistici validi per l’interpretazione dei dati provenienti da analisi di biologia molecolare al fine di estrarre inferenza e nuova conoscenza. Modelli e strumenti matematici innovativi per l’analisi di sequenze di DNA, RNA e proteine vengono elaborati al fine di creare un corpus di conoscenza relativa alla funzione biologica di varianti clinicamente rilevanti, organizzare le conoscenze ottenute da analisi di dati genomici e proteomici al fine di ottimizzare gli algoritmi di ricerca ed annotazione dei dati stessi per migliorarne l’accessibilità. Vengono inoltre condotti studi di fattibilità e stima di numerosità campionaria per nuovi studi clinici e progetti di ricerca.

 

Progetti di Ricerca in programmazione

Il LISRC prevede di attivare nuovi progetti di ricerca nel 2018.

• L’iniziativa Registri di Malattia è stata realizzata grazie all’utilizzo dell’ambiente Redcap. Nel corso del 2018 saranno realizzati nuovi registri in base alle esigenze dei diversi centri ICSM.

• Il LISRC si occuperà dello studio di nuovi sistemi informatizzati per la ricerca e visualizzazione di dati e referti clinici, anche mediante la collaborazione con aziende del settore.

• Il LISRC implementerà soluzioni avanzate per la gestione integrata di dati a supporto della diagnostica molecolare, includendo anche alberi genealogici e annotazioni di mutazioni rilevate con sistemi di Next Generation Sequencing.

• Il LISRC si occuperà di studiare l’applicazione di metodi di machine learning e deep learning per il supporto alle decisioni in cardiologia molecolare.

• Il LISRC attiverà una collaborazione con la rete internazionale ODHSI per la condivisione di dati di ricerca per studi osservazionali multicentrici.

 

Pubblicazioni

• Nicoletti G, Saler M, Pellegatta T, Tresoldi MM, Bonfanti V, Malovini A, Faga A, Riva F. Ex vivo regenerative effects of a spring water. Biomed Rep. 2017 Dec;7(6):508-514. doi: 10.3892/br.2017.1002. Epub 2017 Oct 18. PubMed PMID: 29188053; PubMed Central PMCID: PMC5702968.

• Giorgi I, Fiabane E, Vittadini G, Anastasi S, Benvenuto A, Malovini A, Balestrino A, Ceriana P. Outcome Evaluation of an Integrated Treatment for Comorbid Alcohol and Nicotine Addiction: An Exploratory Study. Arch Psychiatr Nurs. 2017 Aug;31(4):429-430. doi: 10.1016/j.apnu.2017.01.003. Epub 2017 Jan 19. PubMed PMID: 28693881.

• Nicoletti G, Perugini P, Bellino S, Capra P, Malovini A, Jaber O, Tresoldi M, Faga A. Scar Remodeling with the Association of Monopolar Capacitive Radiofrequency, Electric Stimulation, and Negative Pressure. Photomed Laser Surg. 2017 May;35(5):246-258. doi: 10.1089/pho.2016.4180. Epub 2017 Jan 24. PubMed PMID: 28128685; PubMed Central PMCID: PMC5439422.

• Quaquarini E, Sottotetti F, D'Ambrosio D, Malovini A, Morganti S, Marinello A, Pavesi L, Frascaroli M. Eribulin across multiple lines of chemotherapy: a retrospective study on quality of life and efficacy in metastatic breast cancer patients. Future Oncol. 2017 Apr;13(11s):11-23. doi: 10.2217/fon-2016-0517. PubMed PMID: 28481185.

• Dagliati A, Malovini A, Decata P, Cogni G, Teliti M, Sacchi L, Cerra C, Chiovato L, Bellazzi R. Hierarchical Bayesian Logistic Regression to forecast metabolic control in type 2 DM patients. AMIA Annu Symp Proc. 2017 Feb 10;2016:470-479. eCollection 2016. PubMed PMID: 28269842; PubMed Central PMCID: PMC5333278.

• Sandholm N, Van Zuydam N, Ahlqvist E, Juliusdottir T, Deshmukh HA, Rayner NW, Di Camillo B, Forsblom C, Fadista J, Ziemek D, Salem RM, Hiraki LT, Pezzolesi M, Trégouët D, Dahlström E, Valo E, Oskolkov N, Ladenvall C, Marcovecchio ML, Cooper J, Sambo F, Malovini A, Manfrini M, McKnight AJ, Lajer M, Harjutsalo V, Gordin D, Parkkonen M; FinnDiane Study Group, Jaakko Tuomilehto, Lyssenko V, McKeigue PM, Rich SS, Brosnan MJ, Fauman E, Bellazzi R, Rossing P, Hadjadj S, Krolewski A, Paterson AD; DCCT/EDIC Study Group, Jose C. Florez, Hirschhorn JN, Maxwell AP; GENIE Consortium, David Dunger, Cobelli C, Colhoun HM, Groop L, McCarthy MI, Groop PH; SUMMIT Consortium. The Genetic Landscape of Renal Complications in Type 1 Diabetes. J Am Soc Nephrol. 2017 Feb;28(2):557-574. doi: 10.1681/ASN.2016020231. Epub 2016 Sep 19. PubMed PMID: 27647854; PubMed Central PMCID: PMC5280020. 

• Dagliati, A., Sacchi, L., Zambelli, A., Tibollo, V., Pavesi, L., Holmes, J. H., & Bellazzi, R. (2017). Temporal electronic phenotyping by mining careflows of breast cancer patients. Journal of biomedical informatics, 66, 136-147.

• Dagliati A, Marini S, Sacchi L, Cogni G, Teliti M, Tibollo V, De Cata P, Chiovato L, Bellazzi R. Machine Learning Methods to Predict Diabetes Complications. J Diabetes Sci Technol. 2017 May 1:1932296817706375. doi:10.1177/1932296817706375. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 28494618.

• Mazzanti, A., Maragna, R., Vacanti, G., Kostopoulou, A., Marino, M., Monteforte, N., ... & Napolitano, C. (2017). Hydroquinidine prevents life-threatening arrhythmic events in patients with short QT syndrome. Journal of the American College of Cardiology, 70(24), 3010-3015.